Proiect realizat cu sprijinul unui grant din partea Islandei, Lichtenstein-ului și Norvegiei prin Mecanismul Financiar al Spațiului Economic European

Parteneri

Parteneri acad unibuc

Contact

Propunerile sau sugestiile dumneavoastra le puteti formula verbal la intalnirile cu reprezentantii nostri sau in scris la adresa noastra de contact.

Calea Victoriei 125, Sector 1, Cod postal 010071, Bucuresti, ROMANIA

Telefon: +40 21-212 8640

Fax: +40 21-211-6608

CERCETĂRI PRIVIND CONSERVAREA EX SITU A GENOFONDULUI NATURAL

Academia Romana

Institutul de Biologie Bucuresti

Autori: Mitoi Monica, Blându Rodica

 

 

Cercetări privind conservarea ex situ a genofondului natural în contextul înfiinţării unei bănci de gene la specii vegetale de interes atât conservativ, cât şi biotehnologic din zona Retezat-Ţara Haţegului

 

Conservarea ex situ a speciilor de plante reprezinta conservarea speciilor in afara habitatelor naturale. In cazul in care germoplasma devine periclitata, aceasta poate fi imediat asigurata prin realizarea colectiilor ex situ. Prin banci de gene se intelege material genetic conservat in camp, in cadrul gradinilor botanice, sub forma de stocuri de seminte, colectii in vitro de celule si tesuturi mentinute pe termen mediu si lung sau material biologic crioprezervat. Bancile de gene cuprind exemplare conservate pentru utilizare curentă, multiplicare, cercetare, distribuire, evaluare. Ideal, este ca menţinerea germoplasmei să fie în cantitate suficientă astfel încât să satisfacă necesităţile ulterioare de utilizare.

Primele colecţii au fost realizate încă din anii `20 când au fost puse bazele băncilor de gene pentru speciile de interes agricol în peste 50 de ţări (Plucknett si colab., 1987). De atunci au fost iniţiate numeroase programe internaţionale privind conservarea diversităţii genetice nu numai a speciilor de interes agronomic, ci şi pentru flora spontană.

Colecţiile au fost definite ca fiind centre clasice de menţinere ex situ a materialului vegetal (Fassil si Engels, 1997). Ca urmare a eforturilor globale de conservare a resurselor genetice din ultimele 3 decenii, numărul colecţiilor de germoplasmă a crescut considerabil. Acestea au fost menţinute în diferite condiţii în funcţie de facilităţi, buget, politica natională şi internaţională. Încă din 1960-1970 au fost realizate propuneri de dezvlotare a băncilor de gene care să acopere agrosistemele şi centrele cu biodiversitate ridicată astfel incat colecţiile de germoplasmă sunt rezultat al strategiilor de conservare ex situ.

In ceea ce priveste realizarea colecţiilor in vitro, în ultima perioadă de timp sunt consemnate numeroase studii privind conservarea speciilor cu propagare vegetativă, cu seminţe recalcitrante, specii rare şi periclitate, seminţe ortodoxe şi imature.

Menţinerea în habitatele de origine, dar şi refacerea populaţiilor speciilor de plante pe baza tehnicilor in vitro devine din ce în ce mai importantă datorita in principal schimbarilor climatice accentuate din ultima perioada, dar si a impactului antropic si popularea unor noi zone. Aceste efecte se resimt si in zona rezervatiilor naturale cum este Rezervatia stiintifica Gemenele-Retezat sau Geoparcul Tara Hategului. De aceea se impune realizarea unor programe de conservare a speciilor de plante periclitare si endemice din aceasta zona.

Obiectivele unui program de conservare ex situ ar fi:

  • Stabilirea unor protocoale de conservare in situ si ex situ în funcţie de specie,
  • Optimizarea protocoalelor de conservare in vitro (referitor la etapele procesului de micropropagare - sterilizarea materialului biologic ales, initierea culturilor aseptice, multiplicarea, reprezinta punctul de pornire in stabilirea si optimizarea metodelor de conservare in vitro)
  • Extinderea periodică a diversităţii genetice prin introducerea de material din surse diferite,
  • Stabilirea unei baze de date a bancii de gene.

 

Conform lui Caldecott, J.O., 1996, etapele unui program de conservare ex situ sunt reprezentate de:         

I. Selectarea speciilor candidate

Majoritatea speciilor candidate pentru un astfel de program sunt specii caracterizate prin populaţii mici, izolate, ce prezintă riscul pierderii rapide a variaţiei genetice prin drift genetic. Screeningul ar trebui aplicat populaţiilor care sunt suspectate a prezenta riscul consecinţelor proceselor genetice. Metodele de screening genetic sunt bazate pe markeri biochimici sau moleculari şi evaluarea caracterelor cantitative exprimate fenotipic de către indivizi în populaţie. Diferitele strategii de recoltare a probelor utilizate în conservarea ex situ depind în mare parte de cunoaşterea locaţiei, distribuţia şi diversitatea genetică existentă.

II. Măsurile de conservare ex situ urmaresc stabilirea metodelor adecvate de conservare in functie de caracteristicile  speciei. In cazul speciilor endemice si periclitate din zona Retezat-Tara Hategului se vor testa urmatoarele:

A)     Conservarea ex situ prin culturi in vitro

Aceasta, deşi prezintă riscul aparitiei variabilităţii somaclonale datorata metodelor de regenerare folosite, dar si a mentinerii pe termen mediu si lung a culturilor, joacă un rol extrem de important în conservarea speciilor de plante periclitate, acţionând împotriva dispariţiei speciilor sau populaţiilor în sălbăticie şi reprezintă o sursă continuă de plante utilizate în programe de restaurare. Succesul unei metode de conservare ex situ a variabilităţii genetice a speciilor de plante depinde în mod strict de colectarea probelor in situ (Falk & Holsinger, 1991). Conservarea in vitro, ca tehnică modernă a conservarii ex situ, implică tehnici de culturi celulare utilizate pentru menţinerea şi păstrarea resurselor vegetale cultivate şi crescute in vitro prin procese ce implică subcultivari succesive.

A)     Conservarea ex situ prin criostocare reprezinta o alternativa pentru conservarea resurselor genetice vegetale pe termen lung, intrucat in aceste conditii majoritatea proceselor biochimice si fiziologice sunt incetinite sau complet stopate. Materialul genetic criostocat poate fi reutilizat atat in alte experimente, cat si in programele de repopulare. Printre avantajele metodei de criostocare pot fi enumerate si:

  • pastrarea nealterata pe termen lung a materialului biologic,  fiind o sursa inepuizabila de tesuturi si linii celulare genetic stabile,
  • spre desebire de colectiile in camp se elimina riscul instalarii eroziunii genetice,
  • comparativ cu tehnicile de cultura in vitro care sunt mai laborioase si costisitoare,  este una dintre cele mai eficiente metode de securizare a resurselor genetice.

Pentru ca un sistem de conservare să fie eficient trebuie să îndeplinească anumite condiţii:

  • Abilitatea de a minimiza creşterea şi dezvoltarea plantelor in vitro prin mărirea intervalului dintre subcultivari,
  • Să fie menţinută viabilitatea materialului stocat şi conservarea stabilităţii genetice,
  • Să menţină potenţialul de dezvoltare şi adaptare a materialului biologic conservat când este adus în condiţii fiziologice naturale.

Pentru a asigura o mai mare diversitate genetică a populaţiilor speciilor conservate este necesar ca recoltarea probelor să se realizeze din zone diferite, din subpopulaţii diferite. De aseamenea, este important ca probele sa fie analizate separat, în funcţie de caracteristicile habitatului de origine, în vederea conservării genetice a populaţiilor respective (Segarra-Moragues si colab., 2005).

Managementul germoplasmei conservate în bănci de gene (în câmp, seminţe sau in vitro) presupune anumite activităţi (de Vicente si colab., 2005):

  • § de asigurare a identităţii indivizilor în vederea menţinerii integrităţii genetice, 
  • § de limitare a colecţiilor prin determinarea germoplasmei redundante,
  • § de monitorizare a modificărilor genetice naturale sau apărute ca urmare a intervenţiei omului,
  • § de identificare a genelor importante.

Colecţiile in vitro pot fi clasificate astfel (IPGRI Handbooks for genebanks No. 6, 2003):

–        Colecţii active (active collections) cuprind exemplare pentru utilizare curentă, multiplicare, cercetare, distribuire, evaluare. Sunt în mod normal duplicate ale colecţiilor de bază şi sunt menţinute în condiţii de conservare pe termen mediu şi lung.

–        Colecţiile de bază (base collections) reprezintă un set de exemplare conservate pe termen lung, ce nu sunt utilizate pentru analize de rutină.

–        Colecţii pentru securitate (security backup collection) cuprind exemplare din colecţiile active depozitate în locaţii diferite faţă de colecţiile active şi cele de bază.

–        Colecţiile de arhivă (archive collections) – stoc de germoplasmă depozitată, dar nu este conservată propriu-zis.

Situaţia colecţiilor ex situ în Europa şi în Statele Unite ale Americii, în anul 1996 se prezenta astfel:

Colecţii ex situ în Europa şi USA (FAO 1996)

Instituţii

Numărul achiziţiilor (accesii)

National Seed Storage Laboratory, USA

268 000

N.I. Vavilov Institute (VIR), St. Petersburg, Russia

177 680

IPK, Gatersleben, Germany

103 000

Italian Genebank, Bari, Italy

55 806

BAZ Gene Bank, Braunschweig, Germany

49 418

Hungarian Genebank, Tápiószele, Hungary

45 833

Plant Breeding Acclimatization Institute,

 Radzików, Poland

44 883

Nordic Gene Bank, Alnarp, Sweden

27 303

Centre for Genetic Resources (CGN), Wageningen,

 The Netherlands

20 033

În 2009, National Plant Germplasm System, USDA – United States of Agriculture deţine un număr total de 13184 specii de interes agronomic (http://www.ars-grin.gov/npgs/stats/summary.html). 

Primele bănci de gene au fost realizate între anii 1970-1980 pentru a contracara efectele eroziunii genetice şi a preîntâmpina declinul biodiversităţii. Realizarea acestor bănci de gene nu a fost urmată şi de evaluarea colecţiilor. În 1998, numai 55 de ţări deţineau informaţii privind caracterizarea şi evaluarea colecţiilor (FAO, 1998).      

Disponibilitatea informaţiilor genetice asigură luarea deciziilor şi măsurilor necesare conservării germoplasmei vegetale.

Termenul “caracterizare” reprezintă descrierea unei calităţi sau caracter al unui individ. Caracterizarea resurselor genetice se referă la procesele prin care indivizii sunt identificaţi sau diferenţiaţi. În terminologia băncilor de gene şi a managementului germoplasmei, caracterizarea se referă la identificarea variaţiei ca rezultat al diferenţelor în secvenţele de ADN sau în gene specifice.  

Capacitatea de a identifica variabilitatea genetică este indispensabilă pentru managementul efectiv şi utilizarea resurselor genetice. În vederea realizării unor colecţii valoroase, este necesară conservarea speciilor de plante cu moştenire genetică cât mai amplă, care să asigure o biodiversitate mai mare (Cachiţă-Cosma, 2006).

Abilitatea de evidenţiere a variabilităţii genetice, este indispensabilă în vederea conservării resurselor genetice. Pentru analiza variabilităţii genetice a plantelor regenerate prin tehnicile conservării ex situ, au fost dezvoltate o serie de tehnici, ce pot identifica variabilitatea genetică la nivel fenotipic, citologic, biochimic, molecular (Harding, 1996). 

Numeroşi autori au subliniat importanţa markerilor moleculari în estimarea diversităţii genetice a speciilor de plante periclitate (Chase si colab., 1996,  Fritsch si Reiseberg, 1996). Tehnicile moleculare reprezintă instrumente adecvate utilizate în studiul caracterizării şi managementul variabilităţii genetice, ceea ce este extrem de important în programele de conservare ex situ.

Pentru realizarea unei banci de gene pentru speciile de plante endemice periclitate din zona Retezat-Tara Hategului ar fi necesara o baza materiala constand in aparatura pentru criostocare, pretratamente pentru criostocare, dar si o infrastructura adecvata etapelor de micropropagare, mentinere pe termen mediu si lung si aclimatizare. Astfel pentru:

  • Faza de introducere in cultura si micropropagare sunt necesare spatii pentru preparare medii, pentru spalare sticlarie, sterilizare sticlarie si mediii de cultura, camera sterila de inoculare (nisa cu  flux laminar), camera de crestere si aclimatizare care sa asigure conditii diferite de temperatura, umiditate si iluminare etc. Consumabile necesare: substante utilizate in sterilizarea materialului biologic, reactivi necesari pentru prepararea mediilor, flacoane de diferite marimi pentru initierea si propagarea culturilor in vitro, instrumentar pentru manipularea materialului steril etc.
  • Faza de mentinere pe termen mediu si lung presupune existenta unor incinte precum: 

1. camera de crestere care sa asigure conditii de iluminare, temperatura si umiditate diferite, pentru mentinerea culturilor in vitro pe termen mediu. Aceasta se poate realiza prin diferite metode: scaderea temperaturii suboptimale, utilizarea mediilor de cultura caracterizate prin reducerea sursei de carbon, sarurilor minerale, folosirea osmolitilor etc

2. camera pentru criostocare dotata cu  aparat pentru scaderea treptata a temperaturii, containere pentru azot lichid pentru depozitarea pe termen lung (criotuburi, suporturi pentru depozitare, tije de aluminiu necesare pentru manipularea criotuburilor, alimentarea constanta cu azot lichid). 

Avand in vedere ca mentinerea pe termen lung prin criostocare necesita realizarea unor pretratamente de deshidratare, vitrificare, incapsulare – deshidratare sau racire treptata a materialului biologic sunt necesare numeroase  substante cu rol de deshidratare si  crioprotectie (manitol, zaharoza, sorbitol, glicerol, PEG, ABA, DMSO, alginat etc) in functie de caracteristicile materialului biologic.

  • Faza de reinitierea a culturilor in vitro in urma mentinerii pe termen mediu si lung reprezinta verificarea viabilitatii materialului conservat, regenerarea si aclimatizarea indivizilor obtinuti in cultura in vitro. Consumabile necesare: reactivii utilizati in prepararea mediilor, reactivi pentru testarea viabilitatii celulare, suport pentru cultivarea in conditii ex vitro (vase de cultura, solutiii nutritive, tratamente pentru combaterea bolilor determinate de fungi, bacterii,  diversi paraziti).
  • Realizarea verificarii stabilitatii genetice in mod periodic pe parcursul perioadei de stocare

Aparatura pentru biologie moleculara  si biochimie pentru verificarea a stabilitatii genetice: PCR, aparat electroforeza, balante analitice, centrifugi, pH-metre, bai de apa, sursa de curent pentru aparate de electroforeza, spectrofotometru, soft pentru analiza gelurilor etc.

Consumabile: kituri de izolare a ADN, kit de amplificare PCR, agaroza, primeri, markeri de greutate moleculara, etc.

  • De asemenea, un rol important in monitorizarea unei banci de gene il are si realizarea unei baze de date. Pentru aceasta este necesar un soft  in vederea crearii si gestionarii  bazei de date cum ar fi Windows XP Professional, Microsoft Office 2003 Professional Edition, Visual FoxPro 9.0, JavaScript, VBA, ASP

Fisiere atasate acestui articol